Razlika med PCR in QPCR - Razlika Med

Razlika med PCR in QPCR

Glavna razlika - PCR proti QPCR

PCR (verižna reakcija s polimerazo) in qPCR (kvantitativna PCR) sta dve tehniki, ki se uporabljata v biotehnologiji za amplifikacijo DNA za različne namene. PCR je sorazmerno preprosta tehnika. qPCR je znan tudi kot PCR v realnem času ali digitalni PCR. The glavna razlika med PCR in qPCR PCR je kvalitativna tehnika, medtem ko je qPCR kvantitativna tehnika. PCR omogoča branje rezultata kot „prisotnost ali odsotnost“. Toda pri qPCR se količino DNA, pomnoženo v vsakem ciklu, količinsko opredeli. Če se v PCR uporabi RNA, je tehnika znana kot RT-PCR (reverzna transkripcija PCR), in če se RNA uporablja v qPCR, je tehnika znana kot qRT-PC.

Pokrita ključna območja

1. Kaj je PCR
- Opredelitev, procesi, uporabe
2. Kaj je QPCR
- Opredelitev, procesi, uporabe
3. Kakšne so podobnosti med PCR in QPCR
- oris skupnih funkcij
4. Kakšna je razlika med PCR in QPCR
- Primerjava ključnih razlik

Ključni pojmi: elektroforeza z agaroznim gelom, amplikoni, DNA polimeraza, fluorescentno barvanje, PCR, sonde, qPCR, RT-qPCR


Kaj je PCR

PCR se nanaša na tehniko v biotehnologiji, ki omogoča analizo kratkega zaporedja DNA z ojačanjem izbranega segmenta DNA. To je razmeroma občutljiva metoda, saj je zaradi ene same reakcije potrebna zelo majhna količina. Tehnika temelji na sposobnosti DNA polimeraze za sintezo novih pramenov DNA na ponujeno šablono predloge na komplementarni način. Reakcijska zmes PCR je sestavljena iz DNA polimeraze, DNA nukleotidov, primerjev, DNA vzorca, ki ga je treba ojačati, in magnezija. Ojačitev se izvaja znotraj termociklerja. DNA polimeraza mora biti toplotno odporna, saj se pri tej reakciji uporabljajo visoke temperature. Dve vrsti DNA polimeraz, ki se uporabljata v PCR, sta Taq DNA polimeraze in Pfu DNA polimeraza. Taq DNA polimeraza se pogosto uporablja v PCR.

DNA polimeraza zahteva predhodno obstoječo DNA verigo na 3 'koncu, da sintetizira novo verigo. Zato se v reakcijsko zmes doda oligonukleotidni premaz za začetek sinteze DNA. Zahteva za primer v PCR omogoča pomnoževanje samo določene regije v predlogi. Ciljna sekvenca je obkrožena s prednjima in povratnima začetnicama. Na koncu PCR se imenujejo nove kopije specifičnega zaporedja DNA amplikoni, se kopičijo v milijardah. Komponente PCR je treba optimizirati na tak način, da se izboljša učinkovitost PCR, medtem ko se zmanjša neuspeh. Standardna reakcija PCR je prikazana v slika 1.


Slika 1: PCR

Koraki PCR

Trije koraki PCR so opisani spodaj.

  1. Denaturacija - Dvotirna DNA-vzorca se loči na dve enojni verigi z segrevanjem na 94-95 ° C.
  2. Žarjenje - Premiki naprej in nazaj se vežejo na komplementarne sekvence v predlogi. Temperatura je odvisna od temperature taljenja kombinacije premazov.
  3. Podaljšanje primera - DNA polimerazni encim razširi vsak primer na njihov 3 'konec z dodajanjem komplementarnih baz na rastočo verigo. Optimalna temperatura Taq polimeraze, t.j. 72 ° C, uporabimo kot temperaturo v koraku razširitve. Čas podaljšanja je odvisen od števila baznih parov v nizu predloge.

Tri korake ponovimo 28-35-krat. Elektroforeza z agaroznim gelom se uporablja za frakcioniranje velikosti produktov PCR. Produkt obarvamo z etidijevim bromidom in opazujemo pod UV. Produkt PCR ali pomnožena DNA lahko uporabimo pri kloniranju, sekvenciranju ali genotipizaciji.

Kaj je QPCR

QPCR se nanaša na tehniko v biotehnologiji, ki omogoča odkrivanje, karakterizacijo in kvantifikacijo nukleinskih kislin za različne aplikacije. To je vrsta kvantitativne PCR. Tako DNA kot RNA lahko uporabimo kot qPCR. Če se RNA uporablja kot šablona, ​​jo je treba najprej reverzno prepisati v cDNA. Tako je ta vrsta qPCR znana kot RT-qPCR. Tradicionalni PCR izvedemo za cDNA ali običajni DNK. Vendar pa se pri qPCR fluorescenčna barvila uporabljajo za označevanje produkta PCR v vsakem koraku cikla PCR. To omogoča zbiranje podatkov, ko napreduje PCR, kar omogoča kvantifikacijo amplikonov med eksponentno fazo PCR. Glavna vrsta barvila, ki se uporablja v qPCR, je SYBR Green. Barva se veže na dvojno verigo DNA. Ker se fluorescenca sorazmerno poveča s količino pomnožene DNA, se kvantifikacija lahko izvede v »realnem času«. Glavna pomanjkljivost uporabe barvila je, da omogoča količinsko opredelitev enega specifičnega proizvoda v vzorcu. Poleg barvil se lahko v procesu kvantifikacije uporabljajo tudi sonde. TaqMan sonde so eden od glavnih tipov oligonukleotidnih sond, uporabljenih v qPCR, in proces fluorescenčne emisije je prikazan v slika 2.


Slika 2: TaqMan sonda

Sonde se lahko oblikujejo tako, da v istem vzorcu zaznajo več produktov PCR. TaqMan sonda je ena od glavnih vrst sond za hidrolizo; vključitev te sonde v produkt PCR izpostavi fluorofor, ki oddaja fluorescenco. Fluorescentna barvila so bolj specifična za produkt PCR. Zato se uporabljajo v večini diagnostičnih testov za odkrivanje produkta PCR.

Podobnosti med PCR in QPCR

  • PCR in qPCR sta dve vrsti tehnik, ki se uporabljajo v biotehnologiji za amplifikacijo DNA za različne namene.
  • Tradicionalno polimerazno verižno reakcijo izvedemo kot osnovno tehniko v PCR in qPCR.
  • RNA lahko uporabimo tako v PCR kot v qPCR z uporabo povratne transkripcije kot prve reakcije.

Razlika med PCR in QPCR

Opredelitev

PCR: PCR je tehnika v biotehnologiji, ki omogoča analizo kratkega zaporedja DNA z ojačanjem izbranega segmenta DNA.

QPCR: QPCR je tehnika v biotehnologiji, ki omogoča odkrivanje, karakterizacijo in kvantifikacijo nukleinskih kislin za različne aplikacije.

Kvantitativna / kvalitativna

PCR: PCR je kvalitativna tehnika.

QPCR: QPCR je kvantitativna tehnika.

Odkrivanje izdelka

PCR: Produkt detektiramo z elektroforezo v agaroznem gelu v PCR.

QPCR: Produkt lahko odkrijemo v vsakem pomnoževalnem ciklu v qPCR.

Zbiranje podatkov

PCR: Podatki se zbirajo na koncu reakcije v PCR.

QPCR: Podatki se zbirajo med eksponentno fazo reakcije v qPCR.

Resolucija

PCR: PCR ima zelo slabo resolucijo.

QPCR: QPCR ima zelo visoko ločljivost.

Barve

PCR: PCR uporablja etidijev bromid za obarvanje izdelka med PCR.

QPCR: QPCR uporablja fluorescenčne barve za zaznavanje izdelka.

Čas

PCR: PCR je bolj zamudna metoda.

QPCR: QPCR je manj zamuden.

RNA

PCR: RT-PCR je vrsta PCR, ki uporablja RNA kot predlogo.

QPCR: RT-qPCR je vrsta qPCR, ki uporablja RNA kot predlogo.

Vloga

PCR: PCR se uporablja za odkrivanje prisotnosti ali odsotnosti določenih genomskih fragmentov.

QPCR: QPCR se uporablja za kvantificiranje določenega fragmenta v vzorcu.

Zaključek

PCR in qPCR sta dve vrsti tehnik, ki se uporabljajo v biotehnologiji za amplifikacijo DNA za različne namene. PCR je tradicionalna metoda pomnoževanja, ki se uporablja za identifikacijo prisotnosti ali odsotnosti fragmenta DNA. QPCR se uporablja za kvantificiranje določenega fragmenta v vzorcu. PCR je torej kvalitativna tehnika, medtem ko je qPCR kvantitativna tehnika. To je glavna razlika med PCR in qPCR.

Sklic:

1. “QPCR vs. Digital PCR v primerjavi s tradicionalno PCR.” TThermo Fisher Scientific,