Kako deluje DNA zaporedje - Razlika Med

Kako deluje DNA zaporedje

Sekvenciranje je proces, ki sodeluje pri določanju nukleotidne sekvence določenega fragmenta DNA. Med sekvenciranjem je DNA fragment končno označen s fluorescenčno označenimi nukleotidi s PCR. Ta postopek uporablja štiri vrste nukleotidov, označenih s fluorescenco, in so dideoksinukleotidi (ddNTPs). ddNTP nimajo 3 'OH skupine, na katero je vezana fosfatna skupina vhodnega nukleotida. Torej, ko dodamo ddNTP v rastočo verigo, ne bomo več dodajali nukleotidov na 3 'koncu verige. To pomeni, da dodajanje ddNTP v rastočo verigo konča rast verige. Ker se ddNTP dodajo v mešanico PCR v nizkih koncentracijah, se vsaka rastoča veriga konča na različnih nivojih. Odkrije se fluorescenca, ki oddaja, da se določi nukleotidna sekvenca fragmenta DNA na koncu PCR.

Pokrita ključna območja

1. Kaj je DNA sekvenciranje
- Definicija, vrste
2. Kako deluje DNA zaporedje
- Proces sekvenciranja DNA

Ključni pojmi: dideoksinukleotidi (ddNTP), fluorescentni marker, gel elektroforeza, sekvenciranje naslednje generacije, zaporedje nukleotidov, PCR, Sanger sekvenciranje


Kaj je DNA sekvenciranje

DNA sekvenciranje je laboratorijska tehnika, ki se uporablja pri določanju nukleotidne sekvence določene molekule DNA. Uporablja fluorescenčno označene nukleotide, ki so vključeni med PCR. Obstajata dve glavni metodi sekvenciranja, ki temeljita na tehnikah, ki se uporabljata pri odkrivanju fluorescence: Sangerjeva sekvenca in sekvenciranje naslednje generacije.

Sanger Sequencing

Sanger sekvenciranje, ki ga je razvil Fredric Sanger leta 1975, je prva razvita metoda sekvenciranja. Znan je tudi kot metode končne verige od vključen je v selektivno vključevanje ddNTP, ki zaključuje verige in vitro Sinteza DNA. V Sangerjevem zaporedju se amplikoni ločijo z gelno elektroforezo. Sanger sekvenciranje je široko uporabljeno za določanje zaporedja fragmentov DNA, ki se uporabljajo pri kloniranju, in fragmentov, pomnoženih s PCR. Določeno zaporedje DNA je prikazano v slika 1.


Slika 1: DNA sekvenciranje

Zaporedje naslednjih generacij

Najnovejše tehnologije sekvenciranja DNA so skupaj znane kot sekvenciranje naslednje generacije. To je tudi metoda prekinitve verige. Sekvenciranje naslednje generacije uporablja kapilarno elektroforezo za ločevanje amplikonov z različnimi dolžinami, ki jih ustvari verižna metoda. Sekvenciranje naslednje generacije se uporablja pri določanju velikega števila nukleotidov na cikel, kot na primer v sekvenciranju genoma.

Kako deluje DNA zaporedje

Med sekvenciranjem DNA dodamo fluorescenčno označene nukleotide določenemu DNA fragmentu s PCR. Za podaljšanje verige DNA uporabimo redne deoksinukleotide (dNTP). Vendar reakcijsko zmes dodamo ddNTP, ki je označena s fluorescenco. Ker ddNTP-ji nimajo 3-OH skupine v molekuli deoksiriboznega sladkorja, nadaljnja rast verige morda ne bo prišla do konca rasti verige. Sladkor-fosfatni ogrodje DNA nastane z tvorbo fosfodiesterskih vezi med 3 'OH skupino deoksiriboznega sladkorja in fosfatne skupine vhodnega nukleotida. Vendar pa se ddNTP dodajo v majhnih koncentracijah; zato ne prekinjajo rasti verige naenkrat.

V štiri ločene zmesi PCR dodamo štiri vrste ddNTP. Štiri ločene reakcije PCR izvedemo z dodajanjem ddATP, ddGTP, ddCTP in ddTTP. Zato je v vsaki reakcijski zmesi rast verige končana pri A, G, C in T nukleotidih. Na primer, v reakcijski zmesi z dodanim ddATP se rast različnih amplikonov konča pri vsakem A nukleotidu v DNA fragmentu. Določanje zaporedja DNA s Sangerjevim zaporedjem je prikazano v slika 2.


Slika 2: Sanger Sequencing

Vsaka od štirih tipov nukleotidov je označena z ločeno fluorescenčno barvo; ddATP je označen z zeleno barvo; ddGTP je označen z rumeno barvo; ddCTP je označen z modro; ddTTP je označen z rdečim barvilom. Zato so amplikoni štirih reakcij PCR označeni v ločenih barvah.

Po ojačanju zainteresiranega fragmenta DNA amplikone ločimo bodisi z gelno elektroforezo ali kapilarno elektroforezo. Nukleotidno zaporedje fragmenta DNA lahko določimo z detekcijo fluorescence, ki oddaja. Nukleotidno zaporedje 750-1000 baznih parov dolgih fragmentov lahko enostavno določimo na Sangerjevo zaporedje. Določanje nukleotidnega zaporedja celotnega genoma pa je še vedno izzivljivo zaradi velikega števila nukleotidov v genomih. Vendar pa lahko naslednjo generacijo tehnik sekvenciranja, kot je 454 sekvenciranje, preberejo približno 20 milijonov baznih parov na en sam tek.

Zaključek

DNA sekvenciranje je tehnika molekularne biologije, ki se uporablja pri določanju nukleotidne sekvence DNA fragmentov. Med sekvenciranjem se fragmentom fluorescence dodajo DNA fragmenti s PCR. Z odkrivanjem emisione fluorescence lahko določimo nukleotidno sekvenco.

Sklic:

1. "Zaporedje DNA".Khan Akademija,