Kako deluje južni blotting - Razlika Med

Kako deluje južni blotting

Southern blotting je tehnika, ki se uporablja za detekcijo specifičnega fragmenta DNA v vzorcu. Tehnika blotiranja vključuje ločevanje fragmentov DNA glede na velikost z gel elektroforezo, prenos vzorca DNA, ki je razdeljen na velikost, na filtrirno membrano, hibridiziranje specifičnih fragmentov DNA z označeno, s sekvenco specifično sondo in odkrivanje označenih pasov.

Poleg identifikacije specifične DNA v vzorcu, lahko velikost in številčnost določene vrste DNA določimo tudi s pomočjo Southern blotting-a. Postopek, ki je vključen v Southern blotting, je opisan v tem članku.

Pokrita ključna območja

1. Kaj je Southern Blotting
- Opredelitev, načelo, aplikacije
2. Kako deluje južni blotting
    - Proces južnega blotinga

Ključni pojmi: DNK, elektroforeza v gelu, hibridizacijska sonda, najlonska membrana, restrikcijska digestija, južni bloting 


Kaj je Southern Blotting

Southern blotting je hibridizacijska tehnika, ki se uporablja pri identifikaciji specifične DNA v vzorcu. Tehniko je prvič razvil Edward M. Southern leta 1975. Ta proces identificira zaporedja DNA, velikost in številčnost določenega zaporedja DNA znotraj vzorca.

Southern blotting membrana je prikazana v slika 1.


Slika 1: Southern Blotting Membrane

Aplikacije južnega blotinga

V nadaljevanju so opisane aplikacije Southern blotting.

  1. Za odkrivanje določenega fragmenta DNA
  2. Za izolacijo določenega fragmenta DNA
  3. Za identifikacijo mutacij in prerazporeditev genov
  4. V RFLP analizah (polimorfizem dolžine omejevalnih fragmentov)
  5. Identificirati genetske bolezni
  6. Identificirati povzročitelje infekcij
  7. Testiranje očetovstva
  8. V prstnih odtisih DNK za identifikacijo kriminalcev

Kako deluje južni blotting

Južno blotiranje vključuje ločevanje fragmentov DNA glede na velikost z gel elektroforezo, njihovo prenašanje v membrano, njihovo hibridiziranje z označeno sondo, ki je specifična za sekvenco, in odkrivanje označenih pasov. Koraki Southern blotinga so opisani spodaj.

  1. Prebava DNA - Vzorec DNA razgradimo z restrikcijskimi encimi, da dobimo fragmente DNA, in te fragmente pomnožimo s PCR.
  2. Elektroforeza z gelom - fragmenti DNA so frakcionirani z velikostjo z elektroforezo v gelu.
  3. Denaturacija - Gel z frakcionirano DNK namočimo v NaOH ali HCl, da denaturiramo dvoverižno DNA.
  4. Blotting - DNA fragmenti v gelu se prenesejo v pozitivno nabito najlonsko membrano s procesom, imenovanim bloting.
  5. Pečenje in blokiranje - Vpitni papir z fragmenti DNA se peče, da se DNA določi na membrani. Nato so nezasičena vezavna mesta nasičena z obdelavo z govejim serumskim albuminom (BSA) ali kazeinom.
  6. Hibridizacija z označenimi sondami - DNA vezano membrano obdelamo z označeno sondo, ki vsebuje komplementarno nukleotidno sekvenco za zainteresirani fragment DNA.Hibridizacijske sonde so običajno dolge od 100 do 500 bp, označene pa so z radioaktivnimi nukleotidi.
  7. Vizualizacija z avtoradiogramom - Senzorsko vezano membrano se vizualizira pod avtoradiogramom, da dobimo vzorce zainteresiranega fragmenta DNA.


Slika 2: Southern Blotting

Celoten proces Southern blotting je prikazan v slika 2.

Zaključek

Southern blotting je hibridizacijska tehnika, ki se uporablja pri identifikaciji specifičnih DNA zaporedij iz vzorca. V tem postopku se vzorec DNA frakcionira z restrikcijskimi encimi in zmes se izvaja na gelu. Nato se trak pasu v gelu prenese v najlonsko membrano in hibridizira z označeno sondo, kar omogoča detekcijo zainteresiranega fragmenta.

Sklic:

1. "Southern Blotting".Thermo Fisher Scientific,