Kako deluje zahodno - Razlika Med

Kako deluje zahodno

Western bloting je tehnika v molekularni biologiji, ki se uporablja pri detekciji specifičnega proteina v vzorcu. Uporablja SDS-PAGE za ločevanje beljakovin glede na njihovo velikost in te ločene beljakovine se nato prenesejo v membrano. Ta tehnika uporablja specifična primarna protitelesa pri označevanju določenega proteina v blotu. Sekundarna protitelesa, ki so označena z reporterskimi beljakovinami, odkrivajo izbrane beljakovine s primarnim protitelesom.

Pokrita ključna območja

1. Kaj je Western Blotting
- Definicija, dejstva, aplikacije
2. Kako deluje zahodno
- Proces Western Blotting

Ključni pojmi: razvoj barv, nitrocelulozna membrana, primarno protitelo, sekundarno protitelo, zahodno blotanje 


Kaj je Western Blotting

Western bloting je hibridizacijska tehnika, ki se uporablja pri detekciji določenega proteina v vzorcu. Imenuje se tudi imunobloting, ker tehnika uporablja protitelesa za označevanje beljakovin, ki nas zanimajo, in za odkrivanje beljakovin, označenih s protitelesi.


Slika 1: Western blot

Western blotiranje je najprej razvil Towbin leta 1979 in se trenutno uporablja kot rutinska tehnika analize beljakovin.

Kako deluje zahodno

Western bloting se v glavnem uporablja pri detekciji specifičnega proteina v vzorcu. Koraki Western blot tehnike so opisani spodaj.

  1. SDS-PAGE - Vzorec beljakovin se loči glede na njihovo velikost s SDS-PAGE.
  2. Prenos proteinov na membrano - Frakcionirane velikosti se prenesejo v nitrocelulozno ali poliviniliden difluoridno (PVDF) membrano. Tehnike, vključene v ta prenos, so difuzijski prenos.
  3. Blokiranje nespecifičnih spletnih mest - Nezasedena mesta na membrani so blokirana, da se prepreči nespecifična vezava beljakovin. V ta namen se lahko uporabi nemastno suho mleko ali goveji serumski albumin (BSA).
  4. Primarna inkubacija protiteles - Blokirano membrano inkubiramo s primarno raztopino protiteles. Ta primarna protitelesa se vežejo na določeno beljakovino na membrani.
  5. Sekundarna inkubacija protiteles - Membrana se inkubira s sekundarnimi protitelesi, ki se vežejo na primarna protitelesa. Sekundarna protitelesa so konjugirana na reporterske proteine. Te reporterske beljakovine so lahko biotin, alkalna fosfataza ali hrenova peroksidaza.
  6. Zaznavanje beljakovin z razvojem barv - Konjugirani poročevalci encima reagirajo s svojim substratom, da tvorijo barvno alkalno fosfatazo, ki BCIP pretvori v produkt modre barve, medtem ko hrenova peroksidaza pretvarja luminol in oddaja luminesce.


Slika 2: Zahodni blotting - postopek

Zaključek

Western bloting je hibridizacijska tehnika, ki se uporablja pri detekciji prisotnosti določenega proteina v vzorcu. Uporablja SDS-PAGE za ločevanje beljakovin glede na njihovo velikost in vezavo s primarnimi protitelesi, ki jih med razvojem barv lahko prepoznajo sekundarna protitelesa.

Sklic:

1. “Zahodni bloting temeljnega načela, kako Western Blots delo.” TBoster,